[생화학] 제한효소 전기영동 문제점 원인 및 해결방안

문제	원인	해결방안
DNA가 잘리지 않거나 부분적으로 잘리는 경우	DNA가 깨끗하지 않은 경우	DNA를 분광광도계와 아가로즈젤전기영동을 이용하여 정확한 농도와 순도를 확인해야 합니다. 순도가 낮으면 제한효소가 제대로 작용하지 못하게 됩니다. 따라서 Phenol/Chloroform 추출방법으로 단백질을 제거하고, 에탄올침전을 통해 불순물을 제거하거나 또는 DNA 분리kit 등을 이용하여 정제도를 높인 후 제한효소를 처리해야 합니다.
	DNA 농도가 너무 높거나 낮은 경우	DNA 농도가 지나치게 높으면 점도가 높아져 효소반응이 저해를 받게되므로 희석하여 반응하고 너무낮은경우는 반응효소의 Km 값이 낮아지기 때문에 부분절단현상이 나타나게되므로 DNA를 더 첨가하여 반응해야 합니다.
	DNA의 메틸화(dam, dcm, CpG methylation)	이용하는 제한효소가 DNA 메틸화에 영향을 받는지를 확인하여 메틸화에 영향을 받는다면 메틸화에 영향을 받지않는 isoschizomer를 이용하거나, 기질DNA를 메틸라제(methylase) 유전자가 없는 대장균주(예JM110; dam-dcm-)를 이용하여 분리하여 이용해야 합니다. Dpn I과 같은 일부 제한효소는 염기(N6-methylated adenine)에 메틸화 되어 있을 때 작용하므로 methylase 유전자가 있는 대장균주로부터 기질DNA를 분리하여 이용해야 합니다.
	DNA 염기서열정보가 잘못된 경우	DNA의 염기서열에서 제한효소부위와 개수를 확인해야 합니다.
	제한효소가 불활성되거나 약화된 경우	제한효소의 활성도를 나타내는 unit은 linear DNA 1㎍을 1시간에 모두 절단 할 수 있는 제한효소의 양을 의미하므로 Lambda DNA나 기질DNA를 이용하여 효소의 활성을 검사하여 활성 상태를 확인해야 합니다. 많은 제한효소는 열에 약해 불활성화되거나 공기에 노출되어 단백질 산화가 되어 변성 될 수 있으므로 제한효소는 장시간 외부 노출을 하지 말고 희석하는 경우나 또는 반응액에 첨가시에도 부드럽게 섞어주어야 합니다.
		제한효소의 실활이 확인되면 새로운 batch를 사용해야 합니다.
	제한효소 반응억제제(inhibitors)가 있는 경우	Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, SDS, CsCl이 오염되어있거나 고농도의 염상태인 경우 제한효소의 활성이 억제 될 수 있습니다. DNA 분리 시 이용되는Phenol/Chloroform 처리 후 에탄올 침전방법 시 시약이 딸려오지 않도록 완전히 제거하도록 하며, 상업적으로 구입이 가능한 DNA 분리kit 등을 사용하는 방법도 있습니다.
	제한효소가 반응액 내에서 완전히 섞이지 않은 경우	제한효소를 마지막에 첨가하고 부드럽게 혼합하여 완전히 섞이도록 합니다(vortex는사용금지)
	제한효소 희석으로 효소활성이 낮아지거나 없어진 경우	제한효소는 가능하면 희석하지 않고 사용하는 것이 좋으나 희석이 필요한 경우 storage buffer나 희석액(diluent)에 희석하여 사용해야 합니다. 바로 사용하는 경우라면, 1x reaction buffer에 희석 할 수 있으나 장시간 보관은 피해야 합니다.
제한효소 활성이 낮을때	효소의 보관이 부적절한 경우	제한효소는 성에 제거 기능이 없는-20°C 냉동고에서 보관하는 것이 최적이며 전용용기 또는 cooler를 이용하는 것이 좋습니다.
	효소를 희석하여 사용보관한 경우	제한효소를 물에 직접 희석하는 것은 좋지 않으며 적절한 희석액에 희석을 해야하고, 희석 후 쉽게 실활되는 경우가 많기 때문에 가능한 빨리 사용해야 하며 이를 냉동보관하는 것은 좋지 않습니다.
	Pipetting error	점도가 높은 용액 DNA나 제한효소를 소량 취할 때 에 실제보다 더욱 소량을 취하는 경우가 있을 수 있으므로 pipetting에 주의해야하며, 경우에 따라서는 DNA나 효소를 희석하여 사용해야 합니다.
	글리세롤에 의한 효소활성방해의 경우	제한효소가 전체반응액의 10%를 넘게되면(즉, 글리세롤농도가5%를넘게되면) 효소활성이 방해를 받게되므로 반응액의 양을 조절하거나 제한효소 양을 줄여야 합니다.
	반응온도를 잘못한 경우	제한효소의 반응온도를 확인하여 적절한 온도에서 효소반응을 실시해야 합니다.
	반응조건이 맞지 않은 경우	제품설명서를 확인해야 합니다.
DNA 절단 band 수가 예상보다 많을 때	비특이적반응(star activity)이 나타난 경우	제한효소의 유사한 염기서열(cognate sequence)에 대한 비특이적 반응은 부적절한 반응조건 때문에 나타나므로 적절한 반응조건을 지키며 깨끗한 DNA를 이용해야 합니다. 비특이적인 반응의 원인: 과량의효소(>100 units/㎍), 5% 이상의글리세롤농도, 망간을비롯한2가이온(마그네슘대신), 적정농도 범위를 벗어난 NaCl 농도, 극단적인 pH (>pH 8.0), DMSO와 에탄올을 비롯한 유기용매의 오염 등
	다른종류의 DNA가 오염된 경우	기질 DNA 분리 시 오염에 의한 다른 종류의 DNA가 포함되어 있을 가능성이 있으므로 DNA를 새롭게 준비하여 이용해야 합니다. 아가로즈전기영동 시에 로딩완충액 또는 전기영동완충액에 다른 DNA 오염 가능성도 있으므로 새로운 것을 이용하는 것 이 좋습니다.
	다른 종류의 제한효소가 존재한 경우	기준이 되는 Lambda DNA나 절단부위의 수가 확실한 기질을 이용하여 DNA band pattern을 확인하여 추가 band가 확인되면 다른 제한효소가 오염되었을 가능성도 있으므로 새로운 batch의 제한효소를 사용해야 합니다.
	DNA 염기서열정보가 잘못된 경우	DNA의 염기서열정보를 자세히 살펴서 정확한 제한효소부위와 개수를 확인해야 합니다.
제한효소 처리 후에 DNA가 Smearing 되거나 관찰되지 않을 때	기질DNA가 부적당한 경우	분광광도계나 아가로즈젤전기영동을 이용하여 DNA의 정확한 농도를 확인하고 RNA나 Guanidine과 같은 염이 오염되어 있는가를 확인해야 합니다. 염이 많은 경우 230nm에서 높은 흡광도를 보이는 점을 이용하여 확인 할 수 있습니다. RNA는 RNase를 처리하여 제거하고, 에탄올 침전방법으로 RNA와 염을 제거한 후 사용해야 합니다.
	비특이적 핵산분해효소(nuclease)의 오염의 경우	EndA(+) 대장균주에서 DNA를 분리한 경우 endonuclease가 오염되어 DNA를 완전히 분해하게 되므로 endA(-) 대장균주를 사용하고, 부득이한 경우 endonuclease를 제거 할 수 있는 DNA정제kit를 이용하는 것이 좋습니다. 반응성분들에 박테리아, 곰팡이 등 이오염되어 있는지 여부를 확인하고 성분자체의 nuclease 오염여부를 확인하여 새로운 시약으로 교체해야 합니다. BSA가든buffer의 경우에는 박테리아나 곰팡이가 증식할 수 있으므로 저온 보관을 해야 합니다.
절단DNA의 ligation 효율이 낮을때	ligation buffer 조성의 문제	ligation buffer내의ATP, DTT 는 쉽게 깨어지는 성분이므로 새로운 buffer를 사용해야 합니다.
	ligation 반응에서 제한효소의 활성이 남아있는 경우	제한효소의 불활성화(heat inactivation, phenol extraction 방법등)를 확실히 한 후 사용해야 하며, 제한효소, ligase, DNA 중에 비특이적핵산분해효소의 오염가능성이 있는 것이 있는지 확인해봐야 합니다.
	ligase 농도가너무낮은경우	blunt end ligation 반응은 sticky end에 비해 더 높은 농도의 ligase를 필요로 하며, 특정 제한 효소 중 에서도 ligation이 잘 안 되는경우(예; Mbo II)가 있으므로ligase 농도를 더 높이거나10% 농도가 되도록 PEG를 추가로 넣고 반응해야 합니다.

 

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출처 : ㈜엘피스바이오텍

편집 : 가브리엘v